固相萃取與固相微萃取應用之原理
一 固相萃取
固相萃取（Solid Phase Extraction，SPE）是一種基于液-固分離萃取的試樣預處理技術，由柱液相色譜技術發(fā)展而來。SPE技術自70年代后期問世以來，由于其高效、可靠及耗用溶劑量少等優(yōu)點，在環(huán)境等許多領域得到了快速發(fā)展。在國外已逐漸取代傳統(tǒng)的液-液萃取而成為樣品預處理的可靠而有效的方法。
SPE技術基于液相色譜的原理，可近似看作一個簡單的色譜過程。吸附劑作為固定相，而流動相是萃取過程中的水樣。當流動相與固定相接觸時，其中的某些痕量物質（目標物）就保留在固定相中。這時用少量的選擇性溶劑洗脫，即可得到富集和純化的目標物。固相萃取可分為在線萃取線萃取前者萃取與色譜分析同步完成；而后者萃取與色譜分析分步完成，兩者在原理上是一致的。
一般固相萃取的操作步驟包括固相萃取柱（即吸附劑）的選擇、柱子預處理、上樣、淋洗、洗脫。在實驗過程中需要具體考慮的因素如下：
1）吸附劑的選擇
a.傳統(tǒng)吸附劑
在環(huán)境分析中最為常用的反相吸附劑較適用于水樣中的非極性到中等極性的有機物的富集和純化。其中有代表性的鍵合硅膠C18和鍵合硅膠C8等。該類吸附劑主要通過目標物的碳氫鍵同硅膠表面的官能團產(chǎn)生非極性的范德華力或色散力來保留目標物。
正相吸附劑包括硅酸鎂、氨基、氰基、雙醇基鍵合硅膠及氧化鋁等，主要通過目標物的極性官能團與吸附劑表面的極性官能團的極性相互作用（氫鍵作用等）來保留溶于非極性介質的極性化合物。由于其特殊的作用原理，在環(huán)境分析中常用于與其它類型的吸附柱聯(lián)用，吸附去除干擾物，實現(xiàn)樣品純化。
離子交換吸附劑則主要包括強陽離子和強陰離子交換樹脂，這些樹脂的骨架通常為苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，主要是通過目標物的帶電荷基團與鍵合硅膠上的帶電荷基團相互靜電吸引實現(xiàn)吸附的。
b.抗體鍵合吸附劑（Immunosorbents-IS）
這類新型吸附劑充分利用了生物免疫抗原-抗體之間的高靈敏性和高選擇性，尤其適應于水中痕量有機物的富集與分離。其特點為，由于絕大多數(shù)有機污染物為低分子量物質，不能在動物體內引發(fā)免疫反應，所以需把待定污染物鍵合到牛血清白蛋白的生物大分子載體上，使其具有免疫抗原活性，再注入純種動物體內（如兔或羊），產(chǎn)生抗體，經(jīng)雜交瘤技術制得相應于該有機污染物的單克隆抗體。將抗體鍵合到反相吸附劑的硅膠表面或聚合物表面（如C18固定相），就制得了抗體鍵合吸附劑，可用于分離、富集特定污染物。研制開發(fā)能專門檢測各種優(yōu)先污染物的單克隆抗體或多克隆抗體已成為SPE技術的前沿研究領域。
抗體鍵合吸附劑洗脫時一般可采用20%～80%的甲醇-水溶液，該類吸附劑經(jīng)冷藏保存可多次使用。進行SPE操作時應根據(jù)目標物的性質選擇適合的吸附劑。表1- 1給除了常用的吸附劑類型及其相關的分離機理、洗脫劑性質和待測組分的性質。
吸附劑的用量與目標物性質（極性、揮發(fā)性）及其在水樣中的濃度直接相關。通常，增加吸附劑用量可以增加對目標物的保留，可通過繪制吸附曲線確定吸附劑用量。
2）柱子預處理
活化的目的是創(chuàng)造一個與樣品溶劑相容的環(huán)境并去除柱內所以雜質。通常需要兩種溶劑來完成任務，第一個溶劑（初溶劑）用于凈化固定相，另一個溶劑（終溶劑）用于建立一個適合的固定相環(huán)境使樣品分析物得到適當?shù)谋Ａ簟Ｃ恳换罨軇┯昧考s為1～2 mL/100 mg固定相。
終溶劑不應強于樣品溶劑，若使用太強的溶劑，將降低回收率。通常采用一個弱于樣品溶液的溶劑不會有什么問題。制得注意的是，在活化的過程中和結束時，固定相都不能抽干，因為這將導致填料床出現(xiàn)裂縫，從而得到低的回收率和重新性，樣品也沒得到應有的凈化。如果在活化過程中柱床出現(xiàn)裂縫，上述活化步驟都得重復。
3) 上樣
將樣品加入到固相萃取柱并迫使樣品溶液通過固定相，使分析物和一些樣本干擾物保留在固定相上。為了保留分析物，溶解樣品的溶劑必須較弱。如果太強，分析物將不被保留，結果回收率將會很低，這一現(xiàn)象叫穿漏（breakthrough）。盡可能使用最弱的樣品溶劑，可以使溶質得到最強的保留或者說最窄的譜帶。只要不出現(xiàn)穿漏，允許采用大體積的上樣量（0.5～1L）。
有時候固定樣品必須用一個很強的溶劑進行萃取，這樣的萃取液是不能直接上樣的。所以萃取液要用一個弱溶劑稀釋，以得到一個合適的溶劑總強度進行上樣。例如一個土壤樣品采用50%甲醇萃取，得到2 mL萃取液，用8 mL水稀釋，得到10%的甲醇溶液，這樣就可以直接上反相固相萃取柱而不存在穿漏問題。
4) 淋洗
分析物得到保留后，通常需要淋洗固定相以洗掉不需要的樣品組分，淋洗溶劑的洗脫強度略強于或等于上樣溶劑。淋洗溶劑必須盡量強，以洗掉盡量多的干擾組分，但不能強到可以洗脫任何一個分析物的程度。溶劑體積可為0.5～0.8 mL/100 g固定相。
淋洗時不宜使用太強溶劑，太強溶劑會將強保留雜質洗下來。使用太弱溶劑，會使淋洗體積加大。可改為強、弱溶劑混合；但混用或前后使用的溶劑必須互溶。
5）洗脫
淋洗過后，將分析物從固定相上洗脫，洗脫溶劑用量一般為0.5～0.8 mL/100 g固定相。而溶劑必須進行認真選擇，溶劑太強，一些更強保留的不必要的組分將被洗出來；溶劑太弱，就需要更多的洗脫液來洗出分析物，這樣固相萃取柱的濃縮功效就會削弱。
在選擇洗脫溶劑時還應注意溶劑的互溶性。后流過柱床的溶劑必須與前一溶劑互溶，一個不與柱內殘留溶劑互溶的溶劑是不能與固定相充分作用的，當然也不會出現(xiàn)適當?shù)囊汗谭峙洌瑢е虏畹幕厥章屎筒焕硐氲膬艋ЧＨ绻褂没ト艿娜軇┯欣щy，就必須干燥柱床；干燥的方法是讓氮氣或空氣通過柱床10～15 min；或離心，干燥效果更好。
綜上所述，固相萃取技術簡便易行，能夠明顯改善色譜分離，延長色譜柱壽命，降低方法檢出限。與傳統(tǒng)的液-液萃取方法相比，SPE固相萃取顯著的優(yōu)勢體現(xiàn)在：提高樣品處理通量；大大減少溶劑的消耗和廢物的產(chǎn)生；回收率高，重現(xiàn)性好；極低的雜質干擾；無乳化現(xiàn)象；多種分離模式選擇；易于實現(xiàn)自動化。但是實驗中所用的消耗品固相萃取柱價格高，實驗所需費用不可忽視。
二 固相微萃取
固相微萃取（Solid-Phase Microextraction,簡寫為SPME）是近年來國際上興起的一項試樣分析前處理新技術。是在固相萃取基礎上發(fā)展起來的，它保留了其所有的優(yōu)點,摒棄了其需要柱填充物和使用溶劑進行解吸的弊病，只要一支類似進樣器的固相微萃取裝置即可完成全部前處理和進樣工作。
固相微萃取主要針對有機物進行分析，根據(jù)有機物與溶劑之間“相似者相溶”的原則，利用石英纖維表面的色譜固定相對分析組分的吸附作用，將組分從試樣基質中萃取出來，并逐漸富集，完成試樣前處理過程。在進樣過程中，利用氣相色譜進樣器的高溫，液相色譜、毛細管電泳的流動相將吸附的組分從固定相中解吸下來，由色譜儀進行分析。
SPME萃取方式的選擇主要與待測物的揮發(fā)性、基質和探針固定相涂層的性質有關。 SPME有三種不同的萃取方式：頂空萃取、空氣萃取和直接萃取。對揮發(fā)性特別強的樣品,可采用頂空或空氣萃取，對于半揮發(fā)性和不揮發(fā)性樣品來說，應采用直接萃取。
影響SPME萃取效率的因素很多，主要是對干擾分析物吸附和解析的因素進行優(yōu)化。影響分析物吸附的主要參數(shù)有纖維表面固定相類型、萃取時間、離子強度、pH值、溫度、樣本體積和攪拌。對于SPME-GC，分析物解析與時間和溫度有關，而對于SPME-HPLC，分析物解析則主要與溶劑類型、體積和時間有關。在實驗過程中萃取效果的影響因素主要有以下幾方面：
1）纖維表面固定相類型
選用固定相時一般應從兩方面考慮：(i)分析物和固定相的極性相匹配，即應當綜合考慮分析組分在各相中的分配系數(shù)、極性與沸點，根據(jù)“相似者相溶”的原則，選取最適合分析組分的固定相；(ii) 靈敏度隨固定相厚度的增加而增加。
2）萃取時間
萃取時間是從石英纖維與試樣接觸到吸附平衡所需要的時間。為保證實驗結果重現(xiàn)性良好，應在實驗中保持萃取時間一定。影響萃取時間的因素很多，如分配系數(shù)、試樣的擴散速度、試樣量、容器體積、試樣本身基質、溫度等。在萃取初始階段，分析組分很容易富集到石英纖維固定相中，隨著時間的延長，富集的速度越來越慢，接近平衡狀態(tài)時即使時間延長對富集也沒有意義了，因此在摸索實驗方法時必須做富集－時間曲線，從曲線上找出最佳萃取時間點，即曲線接近平緩的最短時間。一般萃取時間在15～180 min。
3）離子強度
向液體試樣中加入少量氯化鈉、硫酸鈉等無機鹽可增強離子強度,降低極性有機物在水中的溶解度即起到鹽析作用，使石英纖維固定相能吸附更多的分析組分。一般情況下可有效提高萃取效率，但并不一定適用于任何組分,如Boyd-Boland等在對22種含氮殺蟲劑檢驗中發(fā)現(xiàn)使用多數(shù)組分在加入氯化鈉后會明顯提高萃取效果，但對惡草靈、乙氧氟甲草醚等農(nóng)藥無效；Fisher等在分析酒中污染物時,加入無機鹽的比不加的分析結果高25%。加入無機鹽的量需要根據(jù)具體試樣和分析組分來定。
4）pH
改變pH值同使用無機鹽一樣能改變分析組分與試樣介質、固定相之間的分配系數(shù),對于改善試樣中分析成分的吸附是有益的。由于固定相屬于非離子型聚合物，故對于吸附中性形式的分析物更有效。調節(jié)液體試樣的pH值可防止分析組分離子化，提高被固定相吸附的能力。對于酸性化合物，萃取效率隨pH值降低而提高，在低pH值，酸性化合物的酸-堿平衡移向中性化和物，更有利于分析物被固定相吸附。相反，對于堿性化合物則是隨pH值降低，化合物離子化，萃取效率隨之減小。在實際檢測中發(fā)現(xiàn)，pH值在4～11間改變，對三嗪、硝基苯胺、取代尿嘧啶、硫代氨基甲酸酯、氯代乙酰胺、聯(lián)苯醚、氨基化合物和含氧二唑類除草劑萃取效率無影響。然而在pH 2時，聯(lián)苯醚和二硝基苯胺的萃取效率提高。
5）溫度
分析物進入固定相的平衡時間與萃取溫度有關，因而需要選擇適當?shù)妮腿囟却偈乖诤侠淼臅r間范圍內獲得滿意的靈敏度。對于浸入式SPME，適當升高溫度可使分子運動加快，分子擴散速度更快，從而萃取相/水相之間的平衡時間可以縮短。其對三嗪和硫代氨基甲酸酯的優(yōu)化萃取溫度在55～60℃。對于頂空式SPME，適當升高溫度可以提高液上氣體濃度，從而提高分析靈敏度。其對人體血液和尿液中三嗪類除草劑的最佳萃取溫度介于90～100℃之間。
6）攪拌
萃取效率與分析物在樣本基質和固定相間的平衡有關，而分析物平衡時間與分析物在水相間質量傳遞速率有關。攪拌和超聲波均能使分析物從基質中快速轉移至固定相，從而降低萃取時間。雖然攪拌速度越快，平衡時間越短，但是過度攪拌也會干擾平衡時間和精密度。
7）樣本體積
由于固相微萃取是一個固定的萃取過程，為保證萃取的效果需要對試樣量、試樣容器的體積進行選擇。Denis等在利用頂空法檢測14種半揮發(fā)性有機氯農(nóng)藥的研究中指出，試樣量與試樣容器的體積對于保證結果有很大關系，試樣量與試樣容器體積之間存在有匹配關系，試樣量增大的情況下，重現(xiàn)性明顯變好,檢出量提高。
8）解析
對于SPME-GC來說，GC的汽化室可用于分析物從纖維上的解吸。當溫度上升時，分析物對纖維的親和力下降從而釋放出來。汽化室較小的體積能夠保證解吸下來的分析物由載氣迅速轉入色譜柱。對于大多數(shù)化合物而言，解吸通常在兩分鐘內完成。GC的熱解吸受若干參數(shù)的影響，如汽化室的溫度和載氣的流速等，它們決定了SPME的解吸時間。一般，汽化室溫度的設定在可保持纖維涂層穩(wěn)定的最大溫度。最高解析溫度有助于減少滯留影響。一般SPME-GC的熱解析最佳溫度和時間分別為200～300℃、2～15 min。
SPME-HPLC的聯(lián)用與GC聯(lián)用的不同之處在于解吸過程和探針的形狀，即HPLC是通過使用微量溶劑洗滌萃取纖維來解析萃取物并直接進入后續(xù)的HPLC分析，而非GC快速熱解吸。在SPME和HPLC聯(lián)用中必須解決接口技術，以實現(xiàn)分析物的解吸。
1997年Eisert和Pawliszyn提出了一種自動進樣的SPME-HPLC聯(lián)用裝置—In Tube SPME-HPLC。在HPLC的自動進樣閥和取樣器之間的是一根涂有SPME固定相涂層的GC石英毛細管。當處于進樣位置時，針頭吸入的樣品溶液中的分析物分配到石英管壁的固定相上，切換到裝樣位置時，吸入溶劑，將被吸附的組分轉移到樣品管中。再切換到進樣位置，樣品管內的溶液隨流動相進入分析柱，進行色譜分析。此裝置的特點是自動進樣，避免了峰展寬。Daimon等還提出一種改進的SPME- HPLC接口。在分析時，用電加熱石英纖維的導管，增加解吸率。
SPME與傳統(tǒng)的LLE、SPE相比，快速、簡單、不需要使用溶劑，可以與GC、HPLC聯(lián)用，有好的線性和靈敏度。但是SPME需要專門的萃取器，價格比較昂貴，纖維的使用壽命有限，需要不停更換。